Gentherapie verspricht Erfolg bei Morbus Wilson

Uniklinik Heidelberg
Der Morbus Wilson ist eine seltene angeborene Stoffwechselerkrankung, bei der das Fehlen einer Kupferpumpe zur Speicherung von Kupfer in den Zellen führt. Betroffen sind meist Jugendliche oder junge Erwachsene. Die Ansammlung von Kupfer kann eine Leberzirrhose und neurologische Störungen hervorrufen. Kupfer lagert sich auch in anderen Organen wie Gehirn, Auge, Niere, Herz, Blut und Gelenken ab. Leider wird die Diagnose häufig aus Unkenntnis zu spät gestellt, so daß schwerwiegende Gesundheitsschäden entstehen. Es gibt zwar wirksame Medikamente, die zur Entspeicherung der Kupferdepots und zur Besserung der Symptomatik und Normalisierung der Lebenserwartung führen können. Eine Leberzirrhose ist jedoch nicht mehr rückgängig zu machen. Und die oft ausgeprägten neurologischen Ausfälle lassen sich nicht wesentlich bessern. Da das der Störung zugrundeliegende Gen bekannt ist, erscheint eine Gentherapie vielversprechend. Bis zum tatsächlichen Einsatz bei Patienten ist es allerdings noch ein weiter Weg. Wolfgang Stremmel und Markus Möhler beschreiben, welche Schritte hierzu in der Abteilung Innere Medizin IV am Klinikum der Universität Heidelberg unternommen werden.

"Zunächst bemerkte ich eine verstärkte Akne", erinnert sich Sabine P., 23 Jahre, "später machten sich eine lähmende Müdigkeit und Leistungsschwäche bemerkbar. Innerhalb von drei Wochen trat eine Gelbsucht auf. Ich lag nur noch im Bett. Die Ärzte stellten ein Leberversagen fest und diagnostizierten eine Kupferspeicherkrankheit als Ursache. Als ich ins Leberkoma rutschte, mußte eine Lebertransplantation durchgeführt werden. Danach wurde ich schnell gesund. Der Morbus Wilson war geheilt. Vor kurzem habe ich ein gesundes Kind zur Welt gebracht." Bei Stephan S., 24 Jahre, nahm die Krankheit einen anderen Verlauf: "In der zwölften Klasse des Gymnasiums bemerkte ich plötzlich eine Unsicherheit in der Handschrift. Bald wurde die Schrift unleserlich. Meine Hände zitterten unwillkürlich und später verdrehten sich die Unterarme, ohne daß ich dies beeinflussen konnte. Im Englischunterricht bemerkte ich, daß meine Aussprache weniger artikuliert war als in den vergangenen Jahren. Meine Lehrerin und auch meine Mitschüler konnten mich immer schlechter verstehen. Besonders peinlich war ein häufig auftretender spontaner Speichelfluß aus dem Mund. Oft hatte ich starke Bauchschmerzen. Ich fühlte mich in der Schule nicht mehr wohl, obwohl meine Leistungen sehr gut waren. Ich verließ die Schule. Später wurden die Bewegungs- und Sprachstörungen so erheblich, daß ich mich nicht mehr verständigen konnte und ich bei meinen alltäglichen Verrichtungen auf die Hilfe meiner Mutter angewiesen war. Zu spät wurde die Diagnose einer Kupferstoffwechselstörung gestellt und eine medikamentöse Therapie eingeleitet. Mittlerweile konnte ich im Rahmen der Behindertenförderung den Abschluß als Informatiker schaffen. Gott sei Dank, daß ich noch nicht rollstuhlpflichtig bin!"

Dies sind typische Schicksale von Patienten mit der angeborenen Leberstoffwechselerkrankung Morbus Wilson, die mit einer Häufigkeit von 1 : 30000 in der europäischen Bevölkerung vorkommt. Bei autosomal rezessivem Erbgang kommen heterozygote Merkmalsträger mit einer Häufigkeit von 1 : 200 bis 1 : 400 vor. Betroffen sind in der Regel Jugendliche und junge Erwachsene. Bei der Erkrankung blockieren verschiedene Mutationen des Morbus-Wilson-Gens (Atp7B) in der Leber eine intrazelluläre Kupferpumpe, die Kupfer in das endoplasmatische Retikulum beziehungsweise in den benachbarten Golgi-Apparat der Zelle transportiert, wo es für die Synthese von Coeruloplasmin benötigt wird. Intrazelluläres Kupfer akkumuliert und zerstört aufgrund seiner toxischen Eigenschaften Zellorganellen und führt schließlich zum Zelltod. Durch die verminderte Ausscheidung von Kupfer in die Galle kommt es zur Kupferüberladung in der Leber und später in anderen Organen, vor allem in Gehirn, Auge, Niere, Herz, Blut und Gelenken. Die wichtigsten Komplikationen sind meist die Lebererkrankung und die neurologischen Störungen.

Unbehandelt verläuft der Morbus Wilson chronisch progredient. Die Überlebenschance beträgt Monate bis wenige Jahre. Das Endstadium der Erkrankung ist gekennzeichnet durch eine dekompensierte Leberzirrhose, Aszites, Ösophagusvarizen, Thrombozytopenie und Blutungsneigung. Die fortschreitenden neurologischen Veränderungen führen zu schwerwiegenden motorischen Behinderungen bis hin zur Bewegungsunfähigkeit, so daß die Patienten völlig auf fremde Hilfe angewiesen sind. Zur wirksamen medikamentösen Therapie werden Medikamente zur Entspeicherung der Körperkupferdepots eingesetzt (zum Beispiel D-Penicillamin, Zink). Obwohl dies eine Besserung der klinischen Symptomatik und Normalisierung der Lebenserwartung bewirkt, bleiben oft Restsymptome, die die Lebensqualität deutlich beeinträchtigen. Deshalb wünscht man sich heute eine möglichst frühzeitige Diagnosestellung und eine noch effektivere Therapie. Das wichtigste ist, an diese seltene Erkrankung prinzipiell zu denken, wenn Kinder oder jugendliche Erwachsene über neurologische Störungen klagen oder eine unklare Lebererkrankung entwickeln. Insbesondere muß bei jedem Leberversagen und bei jeder unklaren Hämolyse zunächst ein Morbus Wilson ausgeschlossen werden. Neben der Fahndung nach dem Kayser-Fleischer-Cornealring hilft die Bestimmung der Parameter des Kupferstoffwechsels, um die Verdachtsdiagnose zu erhärten. Durch Analyse eines Leberbiopsiezylinders wird die Diagnose gesichert. Aufgrund der vielfältigen Mutationen im Morbus Wilson-Gen kann bis heute noch keine zuverlässige genetische Testung zur Diagnostik angeboten werden.

Da die Hausärzte bei dieser seltenen Erkrankung mit häufig kompliziertem Verlauf oft überfordert sind, haben sich in Deutschland die an Morbus Wilson Erkrankten zu einer Patientenorganisation zusammengeschlossen. In ihrem "Morbus Wilson-Verein" bekommen sie Rat und Hilfe. Rundschreiben informieren über neue Erkenntnisse und aktuelle Forschungsvorhaben. Regional und national werden regelmäßige Treffen organisiert, auf welchen die Betroffenen mit erfahrenen Ärzten über ihre Krankheit diskutieren und ihre Erfahrungen über die Erkrankung austauschen können. Die Universitätsklinik Heidelberg steht in engem Kontakt zu dieser Patientenorganisation. Ansprechpartnerin ist Beate Rasp, Meraner Str. 17, 83024 Rosenheim, Tel. 08031/249230.

Bei fünf bis zehn Prozent der Fälle kommt es als Erstmanifestation oder nach Absetzen der kupferentspeichernden Therapie zu einem akut verlaufenden Morbus Wilson. Er ist gekennzeichnet durch ein rasch fortschreitendes Leberversagen, häufig einhergehend mit einer hämolytischen Anämie. In über 90 Prozent ist dieser Verlauf tödlich. Deshalb muß bei diesen Patienten frühzeitig die Indikation zur Lebertransplantation gestellt werden. Interessanterweise wird der Stoffwechseldefekt bei Patienten mit Morbus Wilson durch die Lebertransplantation phänotypisch geheilt. Besonders erfreulich ist die Tatsache, daß die Lebertransplantation bei Morbus Wilson mit einer nur ganz geringen postoperativen Komplikationsrate verbunden ist. Für diese Patienten bedeutet die erfolgreiche Lebertransplantation die Chance auf ein neues Leben.

Aufgrund der Einschränkungen, die diese Erkrankung trotz der teuren klinischen Therapieoptionen mit sich bringt, stellt sich natürlich die Frage, ob die angeborene Stoffwechselerkrankung durch Gentherapie korrigiert werden kann. Wenn die Erkrankung frühzeitig erkannt wird, könnte durch die Gentherapie der Stoffwechseldefekt in der Leber korrigiert werden. Eine Organmanifestation mit den beschriebenen Komplikationen und die medikamentöse Dauertherapie würden vermieden werden. In Heidelberg wird ein solches Gentherapieprojekt bei Morbus Wilson zur Zeit ins Leben gerufen. Die Initiative geht von der Abteilung Innere Medizin IV der Ludolf-Krehl-Klinik aus. In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Prof. Strauss am Max-Delbrück-Centrum in Berlin und mit der gentechnisch orientierten Firma HepaVec, Berlin, wird gegenwärtig die professionelle Nutzung dieses innovativen Ansatzes in der Medizin umgesetzt.

Die molekularbiologische Grundlagenforschung führte in den letzten Jahren zum verbesserten pathogenetischen Verständnis von vielen Erbkrankheiten. So konnten inzwischen zahlreiche ursächlichen Defekte hereditärer Erkrankungen aufgeklärt und in ihrer Funktion charakterisiert werden. Mit diesem Wissen wächst die Hoffnung, monogenetisch bedingte Störungen nicht nur symptomatisch zu behandeln, sondern den genetischen Defekt durch Substitution mit der normalen funktionsfähigen Kopie des krankheitsverursachenden Gens korrigieren zu können. Die Leber ist dabei eines der interessanten Zielorgane, da viele dieser monogenetischen Erkrankungen auf isolierten Enzym- oder Transportdefekten der Leber beruhen.

Durch die selektive Einführung einer normalen funktionsfähigen Kopie des krankheitsverursachenden Gens in die betroffene Zellpopulation oder in das betreffende Organsystem kann der monogenetische Defekt korrigiert und die Funktion des Genprodukts analysiert und charakterisiert werden. Für die Untersuchung des Erfolgs des Gentransfers werden vor Versuchen am Menschen Tiermodelle mit vergleichbarem Gendefekt analysiert. Sofern keine "natürlich vorkommenden" verwandten Tiermodelle für monogenetische Erbkrankheiten bestehen, werden Versuchstiere entwickelt, die das Fremdgen zusätzlich ("transgene Tiere") oder nicht mehr ("Knockout-Tiere") exprimieren. Die somatische Gentherapie am Menschen setzt die erfolgreiche Aufklärung der molekularen Pathogenese der Erkrankungen voraus. Experimentell stehen am Menschen der ex-vivo- oder der in-vivo-Gentransfer zur Verfügung. Beim ex-vivo-Gentransfer werden die zu transfizierenden Zellen aus dem Organ, zum Beispiel Hepatozyten nach Hemihepatektomie, gewonnen. In der Zellkultur erfolgt der Gentransfer und die Selektion der erfolgreich transfizierten Zellen. Die genetisch veränderten Zellen werden danach "zurücktransplantiert". Beim in-vivo-Gentransfer wird das therapeutische Gen möglichst selektiv, gezielt und in ausreichender Konzentration in das gewünschte Gewebe des Patienten appliziert. Dieser Transfer kann physikalisch-chemisch, mechanisch mittels Mikroinjektion der Fremd-DNA oder mittels eines viralen Vektors durchgeführt werden. Die Leber ist ein geeignetes Zeilorgan für die unterschiedlichsten Gentransfermethoden, da man Teile der Leber entfernen und das Organ punktieren kann und die Gefäßversorgung doppelt ist.

Bereits 1992 startete die erste klinische Studie zur hepatischen Gentherapie bei einer Patientin mit autosomal dominant vererbter familiärer Hypercholesterinämie. Nachdem bei Knockout-Mäusen der LDL-Rezeptor-Gendefekt durch Gentransfer erfolgreich ersetzt werden konnte, wurden nach einer Leberteilresektion die Gen-korrigierten autologen Hepatozyten einer Patientin zurückinfundiert. Über einen Beobachtungszeitraum von 18 Monaten kam es bei der Patientin zu einer deutlichen Verbesserung der LDL/HDL-Ratio.

Die Erfahrungen bei der familiären Hypercholesterinämie gelten als gentherapeutisches Modell an der humanen Leber. Die Hepatozytentransplantation blieb auch bei fünf weiteren Patienten ohne schwerwiegende Nebenwirkungen. Mit Verbesserung der Technik des Anwachsens der genetisch korrigierten Hepatozyten und der Expression des Transgens sind zusätzliche positive klinische Effekte erreichbar. Erfreulicherweise sind auch bei Patienten mit Morbus Wilson alle wichtigen wissenschaftlichen und klinischen Voraussetzungen für die Anwendung der somatischen Gentherapie erfüllt: Kürzlich konnte der genetische Defekt, der für den Morbus Wilson verantwortlich ist, identifiziert werden. Das Morbus Wilson-Gen (ATP7B) liegt auf dem Chromosomen 13 (13p14.3) und kodiert für ein Membrantransportprotein, das für die Translokation von Kupfer in das endoplasmatische Retikulum beziehungsweise in den Golgi-Apparat verantwortlich ist. Auch wenn bei Wilson-Patienten zahlreiche unterschiedliche Mutationen beschrieben wurden, konnten keine Korrelationen zu den verschiedenen klinischen Verläufen gezogen werden.

Der Gendefekt ist beim Menschen auf die Leber beschränkt. Somit ist es plausibel, daß die gezielte Gen-Korrektur in den erkrankten Lebern bei diesen Patienten zur klinischen Verbesserung der Erkrankung führt. Eine nur partielle Instandsetzung der Aktivität des Wilson-Gens in der Leber könnte bei Morbus Wilson-Patienten zur klinischen Verbesserung führen. Hierfür spricht die klinische Erfahrung, daß heterozygote Wilson-Träger mit einer Restfunktion des ATP7B-Gens biochemisch ausreichend ausgestattet und klinisch völlig asymptomatisch sind.

Bei homozygoten Morbus Wilson-Patienten wird durch die toxische Schädigung kompensatorisch eine Leberregeneration mit Freisetzung leberspezifischer Wachstumsfaktoren induziert. Über ihre intakten Stoffwechselabläufe würden bereits eine geringe Anzahl eingebrachter ATP7B-Gen korrigierter Hepatozyten einen Wachstumsvorteil gegenüber vorgeschädigten Leberzellen erhalten und könnten zur Leberrepopulation führen. Ein vergleichbarer Effekt konnte bereits im Tiermodell für die hereditäre Tyrosinämie mit kontinuierlicher Leberschädigung nachgewiesen werden. Nur eine geringe Anzahl Gen-korrigierter Hepatozyten führte zur Leberrepopulation, zu klinischer Besserung und der Korrektur des Stoffwechseldefektes.

Zur klinischen Erforschung des Morbus Wilson steht neben anderen Tiermodellen die LEC-Ratte ("Long-Evans Cinnamon rat") zur Verfügung. Das Atp7b-Genprodukt der Ratte zeigt eine Homologie von 82 Prozent zum humanen ATP7B-Transportprotein. Durch die toxische Kupferüberladung entwickeln die Tiere im Alter von vier bis sechs Monaten eine fulminante, häufig letale Hepatitis, vergleichbar mit dem humanen fulminanten Leberversagen. Die Therapie mit dem Kupferchelatbildner D-Penicillamin konnte die Häufigkeit der akuten Hepatitis senken und die Überlebenszeit in LEC-Ratten verlängern. Außer der Kupfer-entspeichernden Therapie konnte bei diesen Tieren der Kupfergehalt der Leber auch durch die Transplantation gesunder allogener Rattenhepatozyten direkt in die Leber und somit die Kupferbedingte Leberschädigung deutlich vermindert werden.

Daraus kann der Schluß gezogen werden, daß auch beim Morbus Wilson nur eine gewisse Menge Atp7B-Gen-korrigierter Hepatozyten in der Leber eingebracht werden muß, um das Ziel der Stoffwechselnormalisierung zu erreichen.

Bisher wurden bevorzugt Retro- und Adenoviren als Vektoren der Leber-orientierten Gentherapie genutzt. Zahlreiche erfolgversprechende gentherapeutische Studien sind am Menschen mit rekombinanten Adenoviren in Erprobung, unter anderem für die zystische Fibrose und das Criggler-Najjar-Syndrom. Adenoviren infizieren sich teilende, ruhende und bereits ausdifferenzierte Zellen. Nach Entfernung des E1-Regulationsbereichs im Virusgenom übertragen rekombinante Adenoviren integrierte Fremdgene effizient in infizierte Zellen. Zur Gewinnung rekombinanter Adenoviren wurde bereits 1977 eine humane Verpackungszellinie etabliert. Mit der Entwicklung neuer Verpackungszellen konnten adenovirale Vektoren in hohen Titern produziert und gereinigt werden. Nachteile adenoviraler Vektoren sind insbesondere die geringe Zellspezifität, die Immunogenität adenoviraler Proteine und die vorübergehende Expression des Fremdgens. Um diese Nachteile zu beseitigen, wurden adenovirale Vektoren weiterentwickelt. So konnte die Arbeitsgruppe von Prof. Strauss, Berlin, die Leber-spezifische Expression des LDL-Rezeptorgens mittels regulatorischer Elemente des Hepatitis-B-Virus verbessern. In anderen Tiermodellen wurde die Entwicklung der Immunantwort durch Gabe von Immunsuppressiva vor adenoviraler Injektion verhindert und die Langzeitexpression des therapeutischen Gens mit funktioneller Korrektur des Gendefekts erreicht.

Erfreulicherweise konnten bereits in der Kooperation mit der Berliner Arbeitsgruppe das Atp7B-Gen der Ratte und das humane Atp7B-Gen in rekombinante Adenoviren eingebracht werden. Gegenwärtig werden infektionskompetente rekombinante Adenoviren in etablierten Verpackungszellen produziert und aufgereinigt. Zusätzlich konnten in Vorergebnissen menschliche Lebertumorzellen mit dem Fremdgen transfiziert und auf ihre Expression mittels polyklonaler Antikörper gegen das Wilson-Protein untersucht werden. Es ist nun geplant, den adenoviralen Gentransfer im Tiermodell der LEC-Ratte zu etablieren und auf die Effizienz der Genkorrektur und Normalisierung des Stoffwechseldefektes zu untersuchen.

Wie oben erwähnt, werden diese genkorrigierten Hepatozyten gegenüber den kupferüberladenen Leberzellen einen deutlichen Wachstumsvorteil haben. Das Angehen der genkorrigierten Hepatozyten soll die Normalisierung des Kupferstoffwechsels in der Leber bewirken und die Entwicklung eines Leberversagens beziehungsweise einer Leberzirrhose verhindern. Zur Ermittlung, inwieweit zusätzliche Kupferbelastungen den klinischen Verlauf beeinflussen, werden die transplantierten Tiere unter verschiedenen Kupferkonzentrationen der Nahrung gehalten. Vergleichbar zur Situation am Menschen wird der Effekt auf den Kupferstoffwechsel in den Tieren quantitativ durch die Bestimmung des Kupfers im Serum, Urin und im Trockengewicht der Leber (Leberkupfergehalt) untersucht werden. Sollte es gelingen so bei der LEC-Ratte den Stoffwechseldefekt zu korrigieren, wäre der nächste Schritt zur Gentherapie beim Menschen geebnet.

Autoren:

Prof. Dr. Wolfgang Stremmel, Dr. Markus Möhler
Abteilung Innere Medizin IV, Universitätsklinik Heidelberg
Bergheimer Str. 58, 69115 Heidelberg
Telefon (06221) 56 87 00

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